1.1 HEMOSTASIA: FUNDAMENTOS Y BASES FISIOLÓGICAS

Dr. Vicente Vicente

El sistema hemostático constituye junto al sistema inflamatorio y el inmune un relevante mecanismo de defensa del organismo. Es bien conocido que la hemorragia ha sido un elemento muy destacado desde los primeros vestigios de la civilización. Ya en las pinturas del paleolítico que adornan las cuevas de Altamira, el sangrado en los animales es una imagen habitual. Por otra parte, a lo largo de la historia ha existido un interés constante por aclarar los mecanismos responsables de la hemorragia. Este hecho contrasta con el escaso interés despertado por la trombosis durante siglos. Hoy en día, sin embargo, el estudio de la trombosis concita grandes esfuerzos al ser la mayor causa de mortalidad1. En definitiva, la forma de expresión clínica de una anomalía del sistema hemostático se manifiesta por situaciones muy distintas, como es la diátesis hemorrágica, o el evento de oclusión vascular tras la generación del trombo. Esas dos manifestaciones clínicas expresan el desequilibrio de uno de los brazos de la balanza hemostática.

Como muchos otros aspectos de la medicina moderna, el verdadero conocimiento de los mecanismos reguladores del sistema hemostático comenzó a ser científicamente entendido a lo largo del siglo pasado. Durante los últimos veinticinco años, se ha puesto en evidencia la tremenda complejidad del sistema, en el que participan de forma concomitante un amplio número de proteínas plasmáticas y elementos celulares. Precisamente esa complejidad ha sido incluso utilizada como argumento de discusión entre las corrientes filosóficas de los “creacionistas” frente a los “evolucionistas”2.

ASPECTOS EVOLUTIVOS

El sistema hemostático más sencillo del que tenemos constancia es el del limulus, un ¨fósil vivo¨ de 500 millones de años de antigüedad3. Su sistema hemostático se circunscribe a sus células circulantes (hemocitos), cuya función es la de formar (Figura 1) un tapón reforzado por una proteína gelatinosa conocida como coagulina, ante agresiones externas o en respuesta a una invasión de endotoxina. Un sistema tan simple, presenta ya algunas de las características propias del sistema totalmente desarrollado de los vertebrados superiores.

FIGURA 1.

SISTEMA HEMOSTÁSICO DEL LIMULUS O “CANGREJO DE HERRADURA”

A la izquierda, limulus o cangrejo de herradura. En la imagen de la derecha se observa su sencillo sistema circulatorio muy sencillo, que va a integrar a dos mecanismos de defensa del organismo, el sistema inmune y el de coagulación.

Por una parte, anuncia la cascada enzimática de la coagulación sanguínea, donde una proteína precursora de la coagulina, el coagulógeno, es sensible a una serín proteasa conocida como coagulasa, para dar lugar de forma inmediata a la formación del coágulo y prevenir la exanguinación. Por otra parte, la participación celular, el hemocito, que podemos imaginarlo como un antecesor de la plaqueta (Figura 2).

FIGURA 2.

LA COAGULACIÓN Y LA INMUNIDAD INNATA EN EL LIMULUS

Representación de un hemocito de limulus. Ante la presencia de un determinado patógeno o agente externo, se produce una cascada enzimática a través de los factores B y C que activan la actividad de la coagulasa para generar coagulina (molécula gelatinosa) a partir de colágeno.

Se ha construido una posible ruta de evolución del sistema hemostático (Figura 3), cuyo mecanismo de ensamblaje, mediante la duplicación de genes y la combinación aleatoria de exones, tuvo lugar durante un corto periodo de unos 50 millones de años. Durante los siguientes 450 millones de años el sistema hemostático solamente ha experimentado pequeñas modificaciones3. Estos datos explican el alto grado de homología entre las proteínas que forman parte del propio sistema de coagulación y las pequeñas diferencias observadas entre especies.

Estos datos explican el alto grado de homología entre las proteínas que forman parte del propio sistema de coagulación y las pequeñas diferencias observadas entre especies.

FIGURA 3.

EVOLUCIÓN DEL SISTEMA DE COAGULACIÓN SANGUÍNEA

Posible relación evolutiva del sistema hemostático en vertebrados a partir de un antecesor putativo común con invertebrados. Datos mostrados en años.

El sistema hemostático constituye un activo y dinámico mecanismo de defensa del organismo con la función de mantener constantemente permeable la luz vascular, restablecerla en caso de obstrucción por un fenómeno trombótico y de reparar la lesión en la pared del vaso para impedir una excesiva pérdida sanguínea.

Las manifestaciones clínicas de su desequilibrio, como ya hemos indicado, serán la tendencia hemorrágica o la trombótica. El conocimiento de este sistema es todavía limitado, y si bien se van definiendo las bases para su entendimiento, estamos lejos de conseguir asimilar las íntimas y múltiples interacciones entre sus proteínas, agrupadas clásicamente como proteínas procoagulantes, anticoagulantes y fibrinolíticas, así como su relación con otros sistemas igualmente complejos como el inmune, inflamatorio, tumoral, etc. En definitiva, el equilibrio hemostático es sin duda alguna, un proceso complejo y dinámico4.

Mantener la hemostasia equilibrada o generar la formación de un trombo requiere una serie de reacciones perfectamente coordinadas donde los protagonistas están localizados en diferentes instancias, como son los receptores de membrana, agonistas o ligandos plasmáticos circulantes o bien liberados de las propias plaquetas o de otros elementos celulares (endotelio, monocitos, etc.) y una articulada transmisión de señales bidireccionales intracelulares, etc5,6.

A continuación abordamos los fundamentos y bases fisiológicas del papel que juegan todos estos protagonistas con sus consecuentes interacciones. Iniciaremos la descripción comentando los principales integrantes que participan en el llamado “componente celular” del sistema hemostático (plaquetas y endotelio vascular), y continuaremos por el componente plasmático de la coagulación (proteínas procoagulantes, anticoagulantes y del sistema fibrinolítico).

En ningún momento debemos olvidar que ambos componentes, plasmático y celular, actúan e interaccionan simultáneamente. Sin esta intensa contribución constante el sistema hemostático no podría ejercer su función.

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INTERACCIÓN PLAQUETA/PARED VASCULAR

La integridad vascular es un elemento crucial e indispensable para que se mantenga el equilibrio y no se active el sistema hemostático. La pérdida de la continuidad endotelial propicia la exposición de una superficie claramente trombogénica, como es el subendotelio vascular, a elementos celulares de la sangre, especialmente plaquetas, iniciando la interacción plaqueta-subendotelio que es un mecanismo desencadenante de la formación del trombo. La integridad vascular es un elemento crucial e indispensable para que se mantenga el equilibrio y no se active el sistema hemostático.Es bien conocido que superficies extrañas, sirva de ejemplo los stents, situaciones de desendotelización o roturas de placas de ateroma, dan lugar a un proceso de generación de trombo donde la activación plaquetaria juega un papel muy relevante. En otras situaciones trombogénicas, como es un cuadro séptico, se genera trombina, enzima que tiene capacidad de activar el endotelio vascular y ocasionar la pérdida de su integridad. Diferentes datos experimentales nos muestran que altas concentraciones de trombina son capaces de generar un potente estado protrombótico por alteración de la pared vascular, lo que viene a sumarse al efecto de la activación del sistema de coagulación que también tiene lugar.

Diálogo plaqueta-endotelio

En un adulto, el número de plaquetas circulantes es de aproximadamente 1 x 1012 y mantienen contacto con una superficie revestida de endotelio vascular de unos 1.000m2. Pese a este contacto con el endotelio, pues las plaquetas tienden a circular por las zonas periféricas vasculares, en condiciones normales no hay fenómenos de adhesión, activación y agregación plaquetaria. Las plaquetas en reposo mantienen una forma discoide y solamente tras su activación cambian drásticamente de forma. El hecho de que no exista activación se debe en buena medida al efecto inhibidor de activación plaquetaria que genera el endotelio, pues sintetiza de forma continua prostaglandina I2 y óxido nítrico metaboliza los estimuladores fisiológicos de la activación plaquetaria, como ADP y trombina. La prostaglandina I2 y el óxido nítrico son inhibidores fisiológicos de la agregación plaquetaria.

Cuando hay una desendotelización o alteración de la pared vascular las plaquetas se activarán. En primer lugar tendrán un cambio de forma, adquirirán la capacidad de ser una partícula “pegajosa”, con alta capacidad de adherirse a diferentes superficies y dar lugar a un espacio prohemostático-protrombótico. Estos cambios morfológicos y funcionales van a estar regidos en un primer momento por la activación e interacción de diferentes glicoproteínas de superficie plaquetaria, que ejercen su función como receptores de superficie plaquetaria (Figura 4). En el inicio del fenómeno de la adhesión plaquetaria participan diferentes mecanismos: reclutamiento y sobreexpresión de receptores, así como formación de nuevos epítopes plaquetarios debido a los cambios generados en esos receptores. Las reacciones moleculares indicadas ocasionan cambio de la forma discoide de la plaqueta en reposo a la aparición de múltiples pseudópodos (plaqueta activada) que precede al fenómeno de secreción plaquetaria, que a su vez cierra el círculo de la activación aportando más sustancias que ejercen su función agonista sobre los receptores plaquetarios (Figura 5).

FIGURA 4.

PRINCIPALES INTERACCIONES LIGANDO RECEPTOR PLAQUETARIOS

Interacción de los diferentes agonistas plasmáticos (ADP, epinefrina, fibrinógeno,  trombina, factor von Willebrand, etc.) y los presentes en la matriz subendotelial (colágeno, factor von Willebrand, etc.) con sus receptores plaquetarios específicos.

Principales receptores plaquetarios

Los principales receptores plaquetarios con función definida en la formación del trombo son: glicoproteínas de membrana algunas de ellas caracterizadas por repeticiones frecuentes de leucina en su secuencia de aminoácidos, la familia de las integrinas, los receptores de inmunoglobulinas y, finalmente, los receptores para agonistas solubles, conocidos como “ligandos autocrinos”.

FIGURA 5.

ACTIVACIÓN PLAQUETARIA

(A) Las plaquetas circulan en sangre con una disposición “discoide”.
(B) Cuando experimentan activación, sufren una drástica modificación generando pseudópodos y elongaciones que facilitan la interacción con otras plaquetas y células circulantes.
(C) Como última fase se extiende la plaqueta (spreading) en una amplia superficie donde se ha adherido y activado.

• Receptor rico en leucina: Complejo Glicoproteico Ib-IX-V (GPIb-IX-V)

Pacientes con trastornos congénitos del complejo rico en leucina (síndrome de Bernard-Soulier, SBS) o del FvW presente en el subendotelio (enfermedad de von Willebrand) muestran importantes problemas hemorrágicos por un defecto en la adhesión plaquetaria Cuando la plaqueta en reposo entra en contacto con el subendotelio, se va a poner en marcha de forma inmediata el fenómeno de adhesión plaquetaria al factor von Willebrand (FvW) presente en el subendotelio, y de manera similar al colágeno presente en la matriz subendotelial.

La interacción con el FvW tiene lugar a través de un complejo glicoproteico rico en leucina, como es el receptor GPIb-IX-V, que corresponde al primer fenómeno que da lugar a la adhesión y depósito plaquetario sobre la superficie subendotelial. La glicoproteína GPIb-IX-V, presente en unas 25 000 copias en la membrana plaquetaria, se liga al FvW depositado en el subendotelio, y no al circulante en el plasma, pues el presente en la matriz subendotelial al estar unido al colágeno ha experimentado un cambio conformacional que propicia la interacción FvW-GPIb-IX-V.

El FvW, además del que está presente en el subendotelio, se almacena en los cuerpos de Weibel-Palade y en los gránulos alfa de las células endoteliales y plaquetas, y también se encuentra circulante en el plasma. El FvW liberado del endotelio es el que se deposita en el subendotelio vascular por la unión con el colágeno tipo I y II allí presente. La repercusión clínica del defecto de la interacción GPIb-IX-V y FvW es muy manifiesta y bien conocida. 

Pacientes con trastornos congénitos del complejo rico en leucina (síndrome de Bernard-Soulier, SBS) o del FvW presente en el subendotelio (enfermedad de von Willebrand) muestran importantes problemas hemorrágicos por un defecto en la adhesión plaquetaria.

La interacción FvW con GPIb-IX-V además de ser crucial para el fenómeno de adhesión plaquetaria también es capaz de trasmitir una señal intracelular que ocasiona flujo de calcio y activación de integrinas, aspecto clave en la propagación del fenómeno de adhesión y al inicio de la activación plaquetaria.
Por otra parte, el complejo GPIb-IX-V mantiene una estrecha conexión con el citoesqueleto plaquetario, lo que justifica que los pacientes con SBS muestren plaquetas de gran tamaño (macrotrombocitopenia).

Estudios en los últimos años han aportado un papel más extenso a la función del complejo GPIb-IX-V, puesto que se ha comprobado su interacción con varias proteínas plasmáticas y con receptores de otras células. Se ha demostrado el papel que tiene el complejo en el desplazamiento (rolling) de las plaquetas en el endotelio mediado por selectina P, así como en el control de la interacción plaqueta-neutrófilo.

Además de lo indicado, el receptor GPIb-IX-V tiene una alta afinidad por la trombina que puede facilitar la activación de la familia de los receptores activados por proteasa (PARs), especialmente el PAR1 y PAR4, y que pueden tener una importante repercusión fisiológica en la activación del sistema hemostático.

Finalmente, otra función relacionada al complejo GPIb-IX-V ha sido su capacidad de ligar proteínas de coagulación como los factores XI, XII, cininógeno de alto peso molecular, y también de actuar como correceptor del FVIIa. En definitiva, el complejo rico en leucina queda involucrado en la generación de actividad procoagulante en la superficie plaquetaria, con generación de trombina y fibrina.

Como acabamos de indicar, el complejo GPIb-IX-V además de jugar un papel fundamental en el mecanismo de adhesión plaquetaria (Figura 6), está involucrado en los fenómenos de activación plaquetaria, migración celular (neutrófilos) sobre el endotelio y en la activación del sistema de la coagulación sanguínea.

FIGURA 6.

RUTA DE ACTIVACIÓN PLAQUETARIA

Cuando se produce una lesión endotelial, los componentes de la matriz subendotelial quedan en contacto con los elementos formes de la sangre, en concreto con las plaquetas que circulan en la zona periférica de los vasos. De esta forma el FvW que se encuentra ligado al colágeno se unirá al complejo GPIb-IX-V. Esa interacción será suficiente para trasmitir una señal intraplaquetaria que facilite activación celular que conllevará la modificación conformacional de algunas glicoproteínas plaquetarias, como la GPIIb/IIIa, que será reconocida por sus ligandos plasmáticos (factor von Willebrand y fibrinógeno, especialmente) dando lugar a puentes interplaquetarios, secreción celular y en definitiva a la agregación plaquetaria. El primer estímulo también será un estímulo suficiente para exponer nuevos receptores de membrana que también facilitarán la potenciación de la agregación plaquetaria y la generación de trombina en la superficie celular, dando lugar a la formación del trombo.

• Integrinas plaquetarias

Los receptores plaquetarios que forman parte de la familia de las integrinas son requeridos para una adhesión estable de las plaquetas a la pared del trombo, así como para el propio crecimiento del mismo.

La estructura de las integrinas se refleja por complejos heterodiméricos, cadenas alfa y beta, unidas de forma no covalente con localización transmembrana, con un corto tallo intracelular y uno largo extracelular. Un hecho común a las integrinas es que para que adquieran su capacidad funcional necesitan un cambio conformacional La ausencia del complejo GPIIb/IIIa clínicamente se expresa por un cuadro hemorrágico grave, que es conocido como tromboastenia de Glazmann

  • La integrina más relevante plaquetaria es la conocida como GPαIIbβ3 (conocida también como GPIIb/IIIa). Su presencia en la membrana plaquetaria sobrepasa las 80 000 copias. Hay un amplio número de proteínas que son los ligandos fisiológicos del complejo glicoproteico, como el fibrinógeno, FvW plasmático, fibronectina, vitronectina y CD40L.

La activación de la GPIIb/IIIa también se consigue con un buen número de agonistas solubles, como el ADP, epinefrina, tromboxano A2 (TxA2), trombina y colágeno. La unión con sus ligandos, en especial con el FvW plasmático y fibrinógeno, es un elemento indispensable para se lleve adelante el fenómeno de la agregación plaquetaria. Precisamente, el papel crucial que tiene el complejo GPIIb/IIIa para que haya un adecuado funcionalismo plaquetario, explica que esa integrina se use como diana para terapia antiagregante, ejemplos son los fármacos como abciximab, eptifibatide y tirofibán.

  • La integrina GPα2β1, también conocida como GPIa/IIa, es un receptor que está presente en la membrana plaquetaria entre 1500 y 4000 copias. Esta glicoproteína cuando se activa liga a diferentes tipos de colágeno, y en la formación del trombo se ha visto que potencia la acción de adhesión plaquetaria ejercida por la GPIb-IX-VI y la GPVI.

En la superficie plaquetaria también están presentes otras integrinas, como la GPα2β1 y la GPα6β1, capaces de ligar vitronectina y fibrinógeno la primera, y laminina la segunda. El papel de ambas integrinas en el mecanismo de adhesión plaquetaria no parece ser muy relevante.

• Familia de receptores de inmunoglobulinas y otros receptores adhesivos: GPVI y PECAM-1

La glicoproteína VI (GPVI) pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y es el principal receptor del colágeno presente en la superficie plaquetariaLa deficiencia de GPVI conlleva la existencia de un cuadro hemorrágico, aunque no muy intenso

Estudios in vivo e in vitro han mostrado que la GPVI es un receptor crucial para la formación del trombo. El hecho de que la deficiencia de GPVI sea extremadamente rara justifica el poco avance conseguido en el conocimiento detallado del papel que juega en la hemostasia humana.

La GPVI CD36, se expresa en la superficie plaquetaria 10 000 a 25 000 copias, y también está presente en células mononucleares de sangre periférica, en macrófagos tisulares y células endoteliales. Entre otras funciones se le conoce como receptor de la trombospondina-1, y también interacciona con lipoproteínas de baja densidad y otros lípidos. Su papel funcional se circunscribe en la adhesión plaquetaria y también juega un papel en la generación del trombo, especialmente en situaciones donde existe dislipemia y estrés oxidativo.

Las moléculas de citoadhesión endotelial plaquetaria o receptores PECAM-1 participan activamente en la interacción en la adhesión celular plaqueta-endotelio. Adicionalmente, hay datos experimentales que confirman que también PECAM-1 puede actuar como un regulador negativo de la agregación plaquetaria.

• Receptores plaquetarios para agonistas solubles (Ligandos solubles): Ligandos autocrinos

La activación plaquetaria puede inducirse por mediadores plasmáticos que se generan de diferentes matrices proteicas extracelulares. Esos mediadores, con propiedad activadora, tienen una actividad transitoria, y la mayor parte se degradan o inactivan rápidamente.

Ejemplos de estas sustancias son los nucleótidos ADP y ATP (que se liberan al plasma de los gránulos densos plaquetarios), la serotonina, tromboxano A2 (TxA2) y trombia, que se genera en la superficie plaquetaria. El TxA2 es producido por la vía de la ciclooxigenasa plaquetaria (tromboxano-sintetasa) tras el inicio de la activación plaquetaria.

Todos los agonistas solubles activan las plaquetas a través de la vía de proteínas G (GPCR).

– P2Y12, es un receptor del ADP que constituye una diana de primer orden en la terapia antiagregante en patología cardiovascular. Tiene un mecanismo de inhibición del receptor y ejemplo son los fármacos clopidogrel, prasugrel y ticagrelor que con una clara función inhibitoria en la formación del trombo.

– P2Y1, es un receptor de ADP que se acopla que se acopla a la vía de proteína Gq, y juega un papel predominante en la respuesta inicial plaquetaria, a diferencia de P2Y12 que tiene su mayor actividad en fases más tardías.

Por otra parte, las plaquetas humanas tienen dos receptores para la trombina: PAR-1 y el PAR-2.

Su estimulación, especialmente de PAR-1, da lugar a una inducción muy potente de activación plaquetaria, en gran medida vehiculizada por la vía de la proteína G4.

Recientemente, se ha abierto un nuevo campo de búsqueda de agentes de inhibición de la activación plaquetaria utilizando antagonistas de PAR-1.

La plaqueta cuenta con un receptor para el tromboxano A2, que es inhibido por la AAS, y otro también para la serotonina, denominado receptor 5-HT2A, que también se acopla a la vía de proteína Gq.

• Proteínas adhesivas

En numerosas ocasiones la formación del trombo se genera por la interacción plaquetaria con un vaso dañado. En esa interacción se desencadenan múltiples reacciones de forma concomitante, y a veces mediadas por un mismo estímulo que sigue distintas direcciones.

Por una parte la plaqueta inicia su reacción con el fenómeno de adhesión que conlleva su activación inmediata, que a su vez se potencia por la presencia de agonistas solubles.

Las sustancias activadoras provienen en buena medida de las propias proteínas secretadas por la plaqueta, así como por enzimas activadas generadas en la activación del sistema de la coagulación, especialmente la trombina y otros factores de coagulación activados.

Todo ello ocasiona el ambiente adecuado para generar la formación del trombo que, en definitiva, es el producto de adhesión/agregación plaquetaria a la pared vascular, generación de actividad procoagulante, y como paso final la generación de fibrina (Figura 7) que constituirá la “cimentación” del trombo.

El trombo es el producto de adhesión/agregación plaquetaria a la pared vascular, la generación de fibrina que constituirá la “cimentación” del mismo
FIGURA 7.

COÁGULO DE PLAQUETAS-FIBRINA

La agregación plaquetaria es un elemento importante que contribuye de forma decisiva a la generación de trombina in situ, lo que da lugar a la formación del trombo. Los agregados plaquetarios se encuentran atrapados por redes de fibrina.

Como ya indicamos previamente el FvW es una proteína con un especial protagonismo en el mecanismo de la formación del trombo. El FvW es una proteína constituida por múltiples subunidades, y cada subunidad contiene 2050 aminoácidos. Las subunidades están enlazadas por puentes disulfuro y dan lugar a grandes multímeros con una elevada masa molecular. El FvW que circula en una forma globular, y en situaciones de alta turbulencia adopta una disposición filamentosa o lineal adquiriendo una gran afinidad para ligarse al complejo GPIb-IX-V.

Las grandes formas filamentosas tienen una actividad hemostáticamente mucho más activa que las globulares, puesto que tienen posibilidad, a través de diferentes dominios de su molécula, de interaccionar con plaquetas, endotelio y colágeno subendotelial.

Deficiencias cuantitativas o cualitativas del FvW dan lugar a los diferentes tipos del trastorno hemorrágico conocido como enfermedad de von WillebrandEn el plasma contamos con un mecanismo de seguridad para que no exista una hiperactividad de las formas de alto peso molecular del FvW, se trata de la proteasa ADAMTS-13. Esa proteasa, de origen hepático, rompe los grandes multímeros del FvW en formas más pequeñas con reducida actividad hemostática.

Modificaciones de los niveles circulantes plasmáticos de ADAMTS-13 tienen su expresión clínica, pues un incremento de la proteasa puede interferir la adhesión plaqueta-FvW, y conlleva un mayor riesgo hemorrágico, mientras que una clara disminución de ADAMTS-13, que acontece en diferentes microangiopatías, incrementa la interacción con plaquetas y por tanto un mayor riesgo oclusivo

El colágeno fibrilar tipo I y IV que forman parte de la matriz subendotelial son potentes activadores plaquetarios interaccionando con los receptores plaquetarios GPVI y GPα2β1, favoreciendo la generación y crecimiento del trombo.

Una de las proteínas con mayor presencia cuantitativa en el plasma es el fibrinógeno, y también está presente en los gránulos alfa plaquetarios y en megacariocitos. El fibrinógeno participa de forma importante en la agregación plaquetaria estableciendo puentes interplaquetarios al ligarse a la integrina α2β3 o GPIIb/IIIa de plaquetas cercanas.

La fibronectina y la vitronectina también son ligandos de las integrinas plaquetarias y juegan un papel en la activación plaquetaria. Clínicamente el defecto más relevante de estas proteínas adhesivas es la deficiencia de fibrinógeno, debido especialmente a la incapacidad de poderse generar fibrina, aspecto crucial para la formación de un trombo estable.

Otras dos proteínas con propiedades adhesivas y que tienen un papel bien definido en el diálogo plaqueta-pared vascular son la trombospondina-1 y la laminina.

– La trombospondina-1 se libera de los gránulos alfa y se liga a la GPIV, contribuyendo a la activación plaquetaria. Adicionalmente, la trombospondina-1 participa en el control del tamaño de los multímeros de FvW, y tiene otras funciones vinculadas a la cicatrización de heridas y en el proceso de angiogénesis.

– La laminina, que tiene lugar su síntesis en la célula endotelial y se deposita en la matriz extracelular y membrana basal, queda expuesta a plaquetas tras la lesión vascular. Cuando esto sucede, la laminina interacciona con las plaquetas a través de la α6β1 y facilita la relación con la GPVI.

En este sentido, debemos considerar que la aplicación de reciente metodología de proteómica, metabolómica o genómica están ayudando a conocer mejor la interacción plaqueta-plaqueta, plaqueta-endotelio y, en definitiva, la formación del trombo. De igual manera, se está produciendo un notable avance en el conocimiento de detalles de la relación plaquetas y endotelio con monocitos, y con proteínas del sistema de la coagulación.

Puede servir de ejemplo el importante papel que se le va confiriendo en estas relaciones al factor tisular (FT), liberado por los monocitos y circulante en plasma con las micropartículas, que son capturadas por el trombo en formación interaccionando con la selectina P, que se expresa en superficie de plaquetas activadas, y con el PSGL-1 presente en las propias micropartículas.

En los últimos años va tomando protagonismo el papel del material extracelular nuclear expulsado de neutrófilos, y presumiblemente de otras células, (NETs, Neutrophils Extracellular Traps) como mecanismo de iniciación y progresión del crecimiento del trombo7.

El material liberado, ADN y otras proteínas como histonas y serin-proteasas, han mostrado su capacidad de activar el sistema de coagulación y las plaquetas. Estos hallazgos no solamente abren nuevas vías de estudio de los mecanismos de generación del trombo, sino que también se puede plantear una nueva vía sugerente de una potencial profilaxis y tratamiento de la trombosis.

En este apartado nos hemos centrado específicamente en los aspectos que a nuestro entender son los más relevantes en los fundamentos y bases fisiológicas de la conocida, durante años, como “hemostasia primaria”, si bien sería mejor definirla como el “compartimento celular” del sistema hemostático, ya que el fenómeno de la hemostasia y generación de trombo no conoce de apartados independientes, sino concomitantes y sinérgicos.

Las reacciones “fisiológicas” están a su vez moduladas y aceleradas por circunstancias patológicas muy relevantes, como puede ser la lesión aterosclerótica y la ruptura de placa.

La lesión aterosclerótica conlleva una combinación de daño endotelial, depósito extenso de material lipídico en la íntima, activación inmune/inflamatoria mantenida, proliferación de células de músculo liso vascular, remodelamiento de la matriz extravascular y todo ello asociado con las posibles alteraciones reológicas en el flujo vascular que puede condicionar la limitación de la permeabilidad vascular. Obviamente, aunque no es objetivo de este capítulo abordar este importante asunto, debemos tener presente todos estos hechos pues tienen una alta influencia en el funcionamiento del sistema hemostático8.

El hallazgo de todas las múltiples y complejas interacciones que modulan el diálogo de plaquetas con el endotelio, entre las mismas plaquetas y con otros elementos celulares circulantes, están ayudando de forma notable a entender la patogénesis de los trastornos trombóticos y, de igual forma, a plantear una terapia antitrombótica más específica.

Hemos comentado un buen listado de moléculas que participan activamente en la formación del trombo, pero no cabe duda que todavía quedan actores por identificar.

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PRUEBAS FUNCIONALES PLAQUETARIAS

Podemos avanzar que las pruebas funcionales plaquetarias durante muchos años han ido más orientadas como herramienta de diagnóstico para trombopatías hereditarias o adquiridas y para la identificación del riesgo de sangrado, que para discriminar el riesgo trombótico9.

En este apartado veremos los ensayos tradicionalmente utilizados (Figura 8A y 8B) separados en tres apartados, métodos globales, otros más específicos y, finalmente, los aplicados recientemente como la tromboelastografía y pruebas similares.

Pruebas globales

  • Una prueba clásica utilizada para evaluar globalmente el buen funcionamiento plaquetario ha sido el tiempo de sangrado o tiempo de hemorragia (TH), pero es bien conocido que tiene importantes limitaciones. De hecho se considera una prueba pobremente reproducible y no predice el riesgo de sangrado quirúrgico. Es una prueba que ya se encuentra en claro retroceso de utilización.
  • El sistema PFA-100 (DadeBehring Inc., Deerfield, IL, EE.UU.) intenta simular lo que sucede en hemostasia primaria a alto flujo (Figura 8C). Pequeñas cantidades de sangre citratada se aspiran a un flujo de 5000-6000 s-1 a través de un capilar. La sangre llega a una membrana con una apertura central de 150 µm recubierta con colágeno-epinefrina o con colágeno-ADP. La adhesión y agregación plaquetaria causan la oclusión de la apertura. Los resultados se informan como tiempos de oclusión en segundos. Actualmente, se considera que este ensayo carece de la sensibilidad y especificidad requeridas para su uso rutinario como test de cribado. Tampoco tiene un papel definitivo ni establecido en la evaluación del riesgo de sangrado en relación con la terapia antiplaquetaria, ya que la aspirina puede prolongar el tiempo de oclusión con colágeno-epinefrina, pero el ensayo es insensible a las tienopiridinas.

Pruebas específicas

  • El estudio de la agregación plaquetaria (Figura 8D) es el método de referencia y el más empleado en la identificación y diagnóstico de la disfunción plaquetaria. El tipo de anticoagulante utilizado en la extracción de la muestra, los agonistas y las concentraciones utilizadas, la concentración de plaquetas y el tipo de agregómetro son variables que tienen influencia sobre la prueba. Por otra parte, también puede cambiar su interpretación el parámetro resultado elegido en la prueba: porcentaje de agregación máxima, tiempo de inicio de agregación o lag-phase, y la pendiente o velocidad de agregación. En definitiva, pese al tiempo transcurrido desde el inicio de la aplicación de la agregación plaquetaria, siguen existiendo bastante cuestiones relacionadas con su estandarización. Si bien se consiguen parámetros reproducibles y útiles para el diagnóstico de trombopatías hereditarias, su utilidad es más que cuestionable para la detección de hiperactivación plaquetaria, y en definitiva para detectar riesgo trombótico.

En un intento de solventar esos problemas, se han desarrollado métodos de “point of care, más estandarizados y sencillos (Figura 8E). Veamos algunos de ellos.

  • Ensayo rápido de funcionalidad plaquetaria (RPFA; VerifyNowAccumetrics, San Diego, CA) es un test que valora la agregación en sangre total de pequeñas esferas de poliestireno recubiertas de fibrinógeno en respuesta a un agonista, TRAP o ADP. Se comercializa como método de detección de resistencia a la aspirina y al clopidogrel, bien correlacionado con los ensayos de agregación y es sensible en la determinación de los efectos del bloqueo de GPIIb/IIIa, pero no puede emplearse para valorar otros aspectos de la hemostasia primaria. Aunque es un test ampliamente probado no existe un consenso generalizado para su uso en las situaciones previamente comentadas.
  • Platelet Works (Helena Laboratories, Beaumont, TX) también es un ensayo que analiza la agregación plaquetaria en sangre total, comparando los recuentos plaquetarios antes y tras la agregación con ADP o con colágeno. También parece existir una buena correlación entre Platelet Works y la agregación convencional. Al igual que otras pruebas ya comentadas, se ha empleado para la detección de resistencia a la terapia antiplaquetaria, pero no ha podido ser validado convenientemente.
  • Ensayo ImpactCone and Plate (let) Analyzer (CPA) (DiaMed, Israel) emplea sangre total que se expone a un flujo uniforme en una cubeta sobre la que gira un cono a gran velocidad, analizándose la adhesión plaquetaria a la superficie de la cubeta y la altura de los trombos. Este ensayo es sencillo de usar y emplea condiciones de flujo fisiológicamente relevantes, siendo capaz de monitorizar el antagonismo de GPIIb/IIIa, al igual que AAS y clopidogrel. Sin embargo, son necesarios estudios adicionales que determinen su papel en el seguimiento de la terapia antiplaquetaria.
FIGURA 8.

LAS HERRAMIENTAS CLÁSICAS PARA EVALUAR LA NORMALIDAD DE LA “HEMOSTASIA PRIMARIA”

A) Recuento y morfología plaquetaria; B) estudio del tiempo de hemorragia (hoy ya en desuso por su falta de reproducibilidad y aportación clínica); C) El sistema PFA-100 que intenta simular lo que sucede en hemostasia primaria a alto flujo; D) agregación plaquetaria utilizando diferentes agonistas (ADP, epinefrina, colágeno, trombina, tromboxano, etc.); E) citometría de flujo que aporta información de la presencia de receptores específicos en la membrana plaquetaria.

Tromboelastografía y similares

La tromboelastografía ya fue utilizada hace varias décadas y cuantifica en sangre total, la fuerza y estabilidad de un trombo formado por la interacción de plaquetas, factores de coagulación, inhibidores, y proteínas fibrinolíticas. Analiza tanto propiedades bioquímicas (formación del trombo y disolución), como mecánicas. En determinados lugares, especialmente en el ambiente de anestesia y quirúrgico, se aplica la tromboelastografía para predicción del sangrado perioperatorio durante el bypass cardiopulmonar, monitorización de la hiper- o hipocoagulabilidad tras cirugía general y la monitorización de agentes farmacológicos que afecten a la coagulación (heparina, HBPM, FVIIa), a las plaquetas (inhibidores de GPIIb/IIIa, aspirina) o a la fibrinólisis (aprotinina, estreptoquinasa). Hay varias modalidades de aparatos en tromboelastografía.

El tromboelastógrafo TEG (Haemoscope) mide la fuerza elástica (rigidez) de un trombo que se forma en el interior de un contenedor oscilante, mediante cambios en la fuerza de torsión que se trasmite a un sensor.

El ROTEG®(Pentapharm) es similar al anterior, excepto que un sistema óptico mide las oscilaciones de un sensor en un contenedor estático, y la formación del coágulo se acelera por el uso de ácido elágico o factor tisular.

El Sonoclot® (Sienco) mide las propiedades viscoelásticas de la formación del trombo y su retracción mediante impedancia a un sensor en vibración.

El PAS (Platelet Analysis System, Hemodyne) mide la fuerza de contracción plaquetaria (dinas) de un trombo formado entre dos superficies, estando la superior conectada a un transductor.

Habiendo revisado previamente los diferentes procedimientos de estudio del funcionalismo plaquetario y su papel en la generación del trombo, en términos generales, podemos indicar que aún no disponemos de buenas herramientas que nos ayuden a establecer el riesgo trombótico o controlar con precisión el efecto de los fármacos antiagregantes.

A continuación abordaremos el estudio del componente plasmático de la coagulación, que acompaña a la activación del componente celular y da lugar a que se lleven adelante las funciones que tiene encomendadas el sistema hemostático.

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COMPONENTE PLASMÁTICO DE LA COAGULACIÓN

Vías de activación de la coagulación

Tal como hemos indicado, el sistema hemostático tiene tres funciones fundamentales: cerrar un vaso dañado, mantener la sangre en un estado fluido y retirar los coágulos una vez restaurada la integridad vascular.

En los años sesenta se describe un modelo enzimático para explicar el proceso de la coagulación sanguínea, que recibió el nombre de cascada de la coagulación sanguínea, el cual estaba compuesto por una vía denominada intrínseca, otra extrínseca y una vía final común para ambos caminos de activación.

Una amplia mayoría de los factores de coagulación son unas proenzimas que se convierten en enzimas activas gracias a su interacción con otros factores previamente activados, dando lugar a una reacción en cadena.

El objeto final de esta cascada enzimática es la activación de la protrombina y su paso a trombina (IIa), que ocasionará el paso de fibrinógeno (soluble) a fibrina10

El estudio de la coagulación in vitro definió dos vías de activación de la coagulación, la vía extrínseca y la intrínseca.

– La vía extrínseca se activa al añadir al plasma un extracto de cerebro animal (tromboplastina tisular).

– Por otra parte, se observó que la sangre recogida en un tubo de cristal se coagulaba por simple contacto con su pared, y a ese proceso enzimático se denominó vía intrínseca.

La fase de activación inicial, en este caso con el vidrio o con otras superficies, se conoce como fase de contacto de la coagulación sanguínea. Sin embargo, hoy sabemos que las llamadas vías intrínseca y extrínseca no funcionan de forma independiente in vivosino que sus mecanismos están íntimamente imbricados, y podemos indicar que durante años ha sido utilizado este esquema como una forma académica para describir un complejo sistema como es el de la  coagulación sanguínea. Hay que indicar, que pese a que estos esquemas se consideran lejanos de la realidad fisiológica, se siguen manteniendo por su utilidad para la exploración in vitro del sistema de la coagulación sanguínea.

Como hemos visto antes, una vez que se daña el vaso, las plaquetas sufren el proceso de adhesión, activación y agregación. A su vez, el factor tisular subendotelial expuesto al fluido sanguíneo genera trazas de trombina, la cual actuará activando diferentes factores de la coagulación. La activación del sistema de la coagulación estará facilitado también por las propias plaquetas, y se irá haciendo de forma exponencial, hasta conseguir un trombo estable de fibrina10.

Factores de coagulación

El sistema de la coagulación está formado por una serie de proteínas plasmáticas denominadas factores de la coagulación.

La mayoría de ellas son proteínas que circulan en la sangre como zimógenos inactivos, los cuales se activan y transforman en enzimas con actividad serín-proteasa, es decir, con potencial proteolítico. Otros factores no tienen actividad proteolítica y actúan como cofactores, facilitando la eficacia de la reacción enzimática.

 Nomenclatura de los factores de coagulación 

  • La designación de los factores de coagulación por un número romano indica el orden de descubrimiento de la proteína, no debiéndolo confundir con su cronología de participación en la secuencia de la reacción enzimática. Por ejemplo, el factor III corresponde al FT y el factor IV se identifica con iones de calcio, esenciales para la progresión de la cascada del sistema de coagulación. Aunque, el factor VI entra en juego antes, esta proteína fue confirmada tiempo después.
  • Cuando queremos representar la forma activada de un factor, a la derecha del número romano se coloca una “a”, por ejemplo el factor X activo lo identificamos como FXa.
  • La mayor parte de los factores de coagulación han sido descubiertos al caracterizar su responsabilidad funcional de una diátesis hemorrágica congénita concreta.

A continuación enumeramos los factores con actividad proteolítica y aquellos con función favorecedora (cofactores) de la reacción enzimática del sistema de la coagulación sanguínea.

Enzimas proteolíticas (serín-proteasas): son las proteínas que circulan como precursores enzimáticos (zimógenos) y se transforman en enzimas activas durante la coagulación. A este grupo pertenecen la calicreína y los factores II, VII, IX, X, XI y XII, así como la proteína C, si bien esta última es un inhibidor o anticoagulante natural como veremos más adelante.

Cofactores: son necesarios para formar complejos con las enzimas y así fijarlas en la superficie celular, así como acelerar la reacción enzimática. En este grupo se incluyen: el cininógeno de alto peso molecular, el FT, los fosfolípidos, el factor VIII y el V y la proteína S, también esta última con función inhibidora.

Otras proteínas. Hay otros dos factores que intervienen directamente en las formación y estabilización del depósito de fibrina, como son el fibrinógeno y el factor XIII.

La mayor parte de los factores se sintetizan en el hígado, y algunos necesitan la presencia de la vitamina K para su normal constitución. Estos son llamados factores vitamina K dependientes, y corresponden a los Factores II, VII, IX y el X, y también lo son las proteínas inhibidoras C y S. La misión de la vitamina K es intervenir en la adición de grupos carboxilo a los extremos aminoterminal del ácido glutámico presente en estas proteínas, para originar residuos gamma-carboxiglutámicos (Gla). Los residuos Gla son fundamentales para que esas proteínas se unan a los iones calcio y a los fosfolípidos y de esta forma permitir que se lleve adelante el proceso coagulativo13.

Ese proceso enzimático es la base de la terapia con antivitaminas K, pues las cumarinas (warfarina o el acenocumarol) inhiben la función de la vitamina K epóxido reductasa (Figura 9).

FIGURA 9.

METABOLISMO DE LA VITAMINA K

La vitamina K participa en el proceso de gamma-carboxilación de los factores de coagulación. Los fármacos antivitamina K o cumarínicos actúan a nivel de la recuperación de la vitamina K activa, desde la forma vitamina K epóxido, para el siguiente proceso de carboxilación.

Sistema de la coagulación

Como veremos a continuación, el inicio de la cascada de la coagulación por el FT unido al factor VII es esencial para el mantenimiento de la hemostasia fisiológica, sin embargo la expresión inadecuada de FT (por ejemplo en una placa aterosclerótica) puede provocar trombosis. Por el contrario, la fase de contacto de la vía intrínseca, en concreto el papel de los factores XI y XII parecen tener un papel menor en mantener una hemostasia normal, pero cada vez hay más datos que apuntan que pueden modular la génesis del mecanismo trombótico10,11,12.

Una visión más reciente del sistema de la coagulación sanguínea lo divide en fases o periodos con una participación mixta de elementos celulares, especialmente en las plaquetas y el endotelio, y proteínas plasmáticas:

  1. Fase de iniciación
  2. Periodo de amplificación
  3. Fase de propagación
  4. Fase de contacto
Dado que participan conjuntamente la activación del sistema enzimático y la interacción con elementos celulares, especialmente las plaquetas, se ha reconocido a este sistema como modelo celular de la coagulación sanguínea10

• Fase de iniciación

Sería en buena medida equivalente a la vía extrínseca clásica. Se inicia cuando el vaso se rompe y las células subendoteliales, como las células musculares lisas o los fibroblastos, se exponen al torrente sanguíneo. Estas células expresan FT, el cual es clave para el inicio de la coagulación12.

En condiciones normales el endotelio y los monocitos no expresan FT, pero pueden hacerlo en respuesta al daño endotelial o a la presencia de estímulos inflamatorios como toxinas, citoquinas, etc.

El FT se une al factor VII provocando su proteólisis y activación, transformándose en factor VII activado (FVIIa). El complejo FT/FVIIa ejerce una acción proteolítica sobre los factores IX y X transformándolos en proteínas activas (FIXa y FXa). En la superficie celular el FXa se une al cofactor FVa y forma el complejo protrombinasa para catalizar el paso de protrombina (factor II) en trombina (Figura 10)12.

FIGURA 10.

COMIENZO Y PRODUCCIÓN INICIAL DE TROMBINA

Fase de iniciación del proceso de coagulación. Ante un estímulo, FT se une al factor VII y lo activa, FVIIa provoca la activación secuencial de FXa y FIXa. FXa unido a FVa forman el complejo protombinasa que cataliza la síntesis de trombina.

• Fase de amplificación

Las trazas de trombina formadas en la fase anterior, van a ser capaces de activar las plaquetas adheridas y convertir el factor V en FVa así como el factor VIII en FVIIIa (Figura 11). El primero va a favorecer la activación del complejo protrombinasa, mientras que el FVIIIa actúa como cofactor para que el FIXa induzca la generación de más cantidad de FXa.

Además, la trombina es capaz de convertir el factor XI en FXIa.

FIGURA 11.

AMPLIFICACIÓN

Fase de amplificación. La trombina producida en la fase anterior, es capaz de activar el resto de factores de la coagulación e incluso contribuir a una mayor activación plaquetaria, por activación del factor XI.

• Fase de propagación

Esta fase ocurre en superficies con fosfolípidos procoagulantes expuestos, como por ejemplo las membranas de plaquetas activadas (Figura 12).

El FXIa convierte el factor IX en FIXa el cual se une al FVIIIa, ambos junto a los fosfolípidos de la superficie celular forman el complejo tenasa, que cataliza el paso de factor X en FXa, el cual unido al FVa producen suficiente cantidad de trombina para formar fibrina.

El último paso es la activación del factor XIII por la trombina. El FXIIIa cataliza la formación de enlaces covalentes entre las cadenas de fibrina dando lugar a un trombo de fibrina polimerizado y estable.

El fibrinógeno es una proteína dimérica formada por tres pares de cadenas polipéptídicas: alfa, beta y gamma, que están unidas entre sí por puentes disulfuro. La trombina actúa sobre el extremo amino terminal de las cadenas alfa y beta rompiéndolas y liberando dos péptidos de bajo peso molecular, denominados fibrinopéptido A y B. Así la molécula de fibrinógeno se trasforma en monómeros de fibrina que polimerizan de forma instantánea. Sobre el polímero de fibrina actúa el FXIIIa, catalizando la formación de enlaces amida entre residuos de glutamina y lisina de las moléculas de fibrina para darles estabilidad.

Por tanto, la fibrinoformación tiene tres etapas:

1) acción de la trombina sobre el fibrinógeno, generando los fibrinopéptidos A y B y monómeros de fibrina

2) polimerización espontánea de los monómeros de fibrina

3) estabilización del coágulo de fibrina gracias a la formación de enlaces covalentes entre los monómeros de fibrina por acción de una transglutaminasa, el factor XIIIa

FIGURA 12.

PROPAGACIÓN

Fase de propagación. Esta ocurre en superficies que contienen fosfolípidos procoagulantes, como por ejemplo las plaquetas activadas. El FXIa convierte el factor IX en FIXa el cual se une al FVIIIa, ambos junto a los fosfolípidos de la superficie celular forman el complejo tenasa, catalizando el paso de factor X en FXa, el cual unido al FVa producen suficiente cantidad de trombina para formar grandes cantidades de fibrina.

• Fase de contacto

Según el modelo de coagulación vigente (Figura 13), la activación del factor XII y XI (fase de contacto) tan solo actuaría en la fase de amplificación11.

Estudios con ratones han demostrado que a la vez que se activa el factor VII también lo hace la fase de contacto. Estos modelos animales han demostrado que mientras la fase de contacto no juega ningún papel en la hemostasia, los pacientes o animales con deficiencia de FXII no sangran, y sin embargo si desarrollan trombosis.

Tres son los activadores que se han descrito capaces activar la fase de contacto7:

– Colágeno
– Polifosfatos presentes en la superficie plaquetar y el ADN plasmático
– NETS

El FXIIa activaría a la precalicreína en calicreína, la cual unida al cininógeno de alto peso molecular, sería capaz de activar al factor XI11.

La activación del FXII y FXI por todos esos elementos parece justificar el papel que juega la vía de contacto promoviendo trombosis, y como su papel en la hemostasia parece ser mínimo, se convierten en una atractiva diana terapéutica. Recientemente se ha publicado un ensayo donde un oligonucleótido anti-factor XI es efectivo reduciendo el riesgo de tromboembolismo venoso tras cirugía ortopédica sin incrementar el riesgo hemorrágico14.

Por otro lado, la calicreína es capaz de inducir la liberación de bradiquinina que induce a la célula endotelial a liberar activador tisular del plasminógeno (que como veremos a continuación participa en el proceso fibrinolítico), formar superóxido y generar óxido nítrico con efecto vasodilatador.

FIGURA 13.

TRES FASES Y TRES SISTEMAS PRINCIPALES DE INHIBICIÓN

Se muestra donde actúan cada una de las proteínas anticoagulantes en relación con las distintas fases del proceso coagulatitvo.

REGULACIÓN DE LA COAGULACIÓN

Mecanismos que regulan el proceso

Existen dos mecanismos que regulan el proceso de la coagulación10:

• Los inhibidores de las serín-proteasas: inhiben el factor activados. Estos son: la antitrombina, el cofactor II de la heparina, el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), el inhibidor de la proteína C activada, inhibidor de C1-esterasa o α1-antitripsina.

El TFPI: es una proteasa inhibidora tipo Kunitz que juega un papel fundamental al inicio del proceso de la coagulación12. Circula en plasma unido a lipoproteínas y un 20% de forma libre. Ante la agresión a un vaso se libera tanto de las plaquetas como del endotelio. La heparina también incrementa su concentración en plasma. Actúa de dos maneras, inhibiendo directamente el FXa o actuando sobre el complejo FT/FVIIa/FXa. Recientemente se ha descrito que la proteína S actúa como cofactor del TFPI en su inhibición del FXa.

Antitrombinaes el principal inhibidor de la trombina y del FXa, aunque también es capaz de inhibir los factores IXa, XIa, XIIa, calicreína y plasmina, así como al FVIIa unido al FT. Su actividad se incrementa mil veces en presencia de heparina. In vivo esta función la cumplen los proteoglicanos tipo heparina (dermatán sulfato, heparán sulfato y condroitín sulfato) presentes en el endotelio vascular y necesarios para el reconocimiento de la antitrombina.

La antitrombina presenta una estructura tridimensional donde el centro reactivo se encuentra parcialmente integrado en la molécula circulante. Además, se identifica una zona de unión a un pentasacárido presente en la heparina y a glucosaminoglicanos vasculares. Precisamente, la unión de la heparina a la antitrombina provoca un cambio conformacional en la serpina, que libera completamente el centro reactivo. Este cambio tiene importantes consecuencias funcionales, dado que la capacidad inhibitoria de esta conformación es 1.000 veces superior a la de la molécula sin heparina. Pero no es este el único cambio conformacional que experimenta la antitrombina. La unión a las proteasas que inhibe, conduce a la ruptura del centro reactivo de la antitrombina. Ese es un proceso clave en el funcionamiento inhibitorio de la serpina que inactiva a la proteasa, y forma el casi indisociable complejo proteasa-serpina.

• Los reguladores de los cofactores, como es el sistema de la proteína C (proteína C, S y trombomodulina) que regula al FVa y FVIIIa.

Sistema de la proteína C: desempeña un papel esencial en la regulación del proceso de la coagulación sanguínea. La activación de la proteína C conduce a la inactivación de los cofactores de la coagulación activados Va y VIIIa, que son esenciales para mantener la formación de trombina.

El sistema de la proteína C se activa cuando la trombina se une a la trombomodulina sobre la superficie endotelial. La activación de la proteína C por el complejo trombina-trombomodulina es potenciada mediante la unión a su receptor específico, el receptor endotelial de la proteína C (EPCR). La proteína C activada (PCa) unida a la forma soluble del EPCR no tiene propiedades anticoagulantes, lo que sugiere que la PCa debe disociarse del EPCR para poder exhibir su función anticoagulante. Una vez tiene lugar esta disociación, la PCa se une a la proteína S sobre la superficie de la célula endotelial o de la membrana plaquetaria, e inactiva proteolíticamente a los cofactores de la coagulación Va y VIIIa.

Sistema fibrinolítico

El sistema hemostático cuenta con un mecanismo de defensa final (Figura 14), como es la eliminación del trombo una vez constituido, despues de la reparación del vaso. El principal agente encargado de eliminar el trombo es una enzima proteolítica llamada plasmina. Su precursor, el plasminógeno, se une a la fibrina y al activador tisular del plasminógeno (t-PA).

El complejo t-PA lleva a la transformación de la proenzima en su forma activa. La plasmina, en unión a la fibrina, no solo es capaz de romper la red polimérica de esta, sino que también actúa sobre el fibrinógeno y otros factores de la coagulación. Al actuar sobre la fibrina libera los productos de degradación de la fibrina, entre los cuales se encuentra el dímero-D. El dímero D consiste en dos dominios D procedentes de dos monómeros de fibrina que han sido unidos covalentemente por el FXIIIa.

La plasmina está regulada por las células endoteliales que secretan dos serin-proteasas activadoras del plasminógeno, t-PA y el activador del plasminógeno tipo urokinasa, junto con dos inhibidores (PAI-1 y PAI-2). Además, la plasmina se inhibe por la α2-antiplasmina, la cual actúa rápidamente una vez la plasmina se activa en plasma. La α2-antiplasmina se produce en el hígado y es también secretada por las plaquetas.

Finalmente, existe una proenzima de una carboxipeptidasa-Β llamada inhibidor de la fibrinólisis activable por trombina o TAFI, que actúa sobre el complejo trombina-trombomodulina y actúa inhibiendo la fibrinólisis, ya que el trombo parcialmente digerido puede ser estímulo para la activación de más moléculas de plasminógeno.

El FXIIIa facilita la unión de TAFI a la fibrina, evitando que el recién formado coágulo de fibrina sea degradado prematuramente.

FIGURA 14.

REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DEL PROCESO FIBRINOLÍTICO

La cascada de reacciones del proceso fibrinolítico se encuentra regulada de forma positiva y negativa por otras moléculas.

EXPLORACIÓN DE LA FASE PLASMÁTICA DE LA COAGULACIÓN

Para la realización de la mayoría de las pruebas de coagulación se necesita la obtención de plasma citratado (citrato trisódico a una concentración 0.129 M) pobre en plaquetas. La obtención de la muestra se hace en tubos precargados con citrato sódico que se deben centrifugar a una velocidad de 3000 g durante 15 minutos en frío. La muestra debe ser procesada antes de las 4 horas, si se mantiene a 4-6 ºC o antes de las 2 horas si se mantiene a temperatura ambiente.

La visión académica de la coagulación en una fase intrínseca, extrínseca y común, es útil para la exploración de los tiempos de coagulación y de los factores que de ellos dependen15.

Tiempo de protrombina

Se utiliza para evaluar la vía extrínseca de la coagulación y la vía común, lo cual implica la normalidad de los factores II, V, VII, X y fibrinógeno. Se obtiene tras añadir tromboplastina tisular al plasma, que aporta factor tisular y fosfolípidos necesarios para iniciar el proceso coagulativo junto con el calcio. Se expresa en segundos, razón normalizada o ratio (tiempo de protrombina del paciente/tiempo de protrombina control) y como actividad (ratio x 100). Es normal una ratio de 0,8-1,2.

Una de las aplicaciones más importantes del tiempo de protrombina es la monitorización de los fármacos anti-vitamina K. El control biológico de los fármacos anti-vitamina debe realizarse con el tiempo de protrombina, expresando su resultado mediante la razón internacional normalizada, más conocida como INRPara estandarizar el resultado y que el grado de anticoagulación de un paciente sea homogéneo en todos los laboratorios independientemente del reactivo que se use, en 1981 la OMS relacionó todas las tromboplastinas del mercado con tres tromboplastinas estándares preparadas por la propia OMS para ello utilizó un índice de sensibilidad internacional (ISI).

  • El ISI corresponde a la pendiente de la recta de regresión que relaciona el resultado obtenido con cualquier tromboplastina frente a la de referencia, que se considera 1.
  • La OMS a partir de ese momento recomendaba usar tromboplastinas con ISI<1,5
  • Actualmente se utilizan tromboplastinas recombinantes cuyo ISI es aproximadamente

cuadro-unidad01-07

La mayoría de los pacientes anticoagulados deben mantener el INR entre 2,0-3,0, salvo los pacientes de muy alto riesgo cuyo INR debe estar entre 2,5-3,5 o incluso entre 3,0 y 4,0.

El control de INR puede realizarse mediante:

– Venopunción. Obtención de una muestra de plasma citratado y realización de la prueba en un coagulómetro automatizado.

– Punción capilar. Permite la determinación inmediata del INR tras obtención de sangre total por punción o microcorte en el pulpejo del dedo en un coagulómetro portátil. Utiliza una tromboplastina con un ISI en torno a 1.

La cuantificación de cada uno de los factores, se hace mezclando la muestra del paciente con un plasma carente del factor a estudiar. La actividad obtenida será por tanto la actividad del factor presente en el plasma a estudio.

Tiempo de tromboplastina parcial activada

Explora la fase de contacto o vía intrínseca, y su normalidad implica valores normales de los factores XII, XI, IX, X, VIII, V, II y fibrinógeno. Se obtiene tras activar la vía de contacto con caolín, sílice micronizado o ácido elágico y añadiendo fosfolípidos y calcio (Figura 15). Se expresa mediante segundos y una razón normalizada. Es normal una ratio de 0.8-1.2.

El TTPA se prolonga ante fármacos con actividad anti-IIa, como es la heparina no fraccionada. De hecho se utiliza para su monitorización, debiendo estar la ratio entre 1.5-2.5. También por tanto se alarga ante otros fármacos anti-IIa como son las hirudinas o el dabigatran. La determinación de los factores de la vía intrínseca, también se realiza con un plasma carente del factor a estudiar, para que así la actividad obtenida corresponda al factor presente en la muestra a estudio.

FIGURA 15.

REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DEL TIEMPO DE PROTROMBINA

Se obtiene tras añadir tromboplastina tisular al plasma, que aporta factor tisular y fosfolípidos necesarios para iniciar el proceso coagulativo junto con el calcio. Se expresa en segundos, razón normalizada o ratio (tiempo de protrombina del paciente/tiempo de protrombina control) y como actividad (ratio x 100). Es normal una ratio de 0,8-1,2. Se utiliza para evaluar la vía extrínseca de la coagulación y la vía común, lo cual implica la normalidad de los factores II, V, VII y X. Se resume las principales causas de su alargamiento.

Tiempo de trombina

Se obtiene al añadir trombina al plasma. Es extraordinariamente sensible a la presencia de fármacos anti-IIa. Existe una variedad del mismo, que es el tiempo de reptilase, donde la trombina es sustituida por un veneno de serpiente que es insensible a heparina, por tanto ante la presencia de esta no se alarga el tiempo (Figura 16).

Para la determinación de la actividad anticoagulante del dabigatrán, se ha creado un tiempo de trombina diluido, donde mediante una curva de calibración pueden extrapolarse los tiempos obtenidos a la concentración del fármaco.

Tiempo de ecarina

Otra prueba derivada del tiempo de trombina, es el tiempo de ecarina. Esta prueba está basada en añadir un activador obtenido de serpiente que transforma la protrombina en meizotrombina, un precursor lábil de trombina. Ambos compuestos son inhibidos por dabigatrán, prolongando el tiempo de coagulación. Existe una correlación lineal entre la prolongación del tiempo de ecarina y la concentración de dabigatrán de la muestra.

FIGURA 16.

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA.

Explora la fase de contacto o vía intrínseca, y su normalidad implica valores normales de los factores XII, XI, IX y VIII. Se obtiene tras activar la vía de contacto con caolín, sílice micronizado o ácido elágico y añadiendo fosfolípidos y calcio. Se expresa mediante segundos y una razón normalizada. Es normal una ratio de 0,8-1,2.

Determinación de fibrinógeno

Se realiza por el método von Clauss, que se basa en añadir un exceso de trombina a un plasma diluido, de tal forma que el tiempo de coagulación obtenido está en relación lineal con la concentración de fibrinógeno.

Determinación del dímero D

La prueba de referencia y más exacta es la determinación del dímero D mediante ELISA o enzimo-inmuno ensayo. Sin embargo, esta es una técnica larga que no permite una respuesta rápida del laboratorio. Por tanto, se han buscado técnicas automatizadas.

Desde hace años venimos utilizando técnicas basadas en aglutinación con látex. Consiste en enfrentar el plasma del paciente a micropartículas de látex unidas a un anticuerpo frente al dímero D. La unión del dímero D del plasma a su anticuerpo provoca una aglutinación de las partículas de látex y un cambio en la turbidez del plasma.

Actividad anti-Xa

Su determinación se realiza por cuantificación de actividad enzimática mediante métodos cromogénicos. En ella se aporta el factor Xa y se mide la actividad Xa residual no inhibida por el complejo heparina/antitrombina de la muestra. Es útil para el control de tratamiento con heparina de bajo peso molecular (HBPM).

Esta misma técnica se emplea para el control de nuevos fármacos anti-Xa usando eso sí, calibradores específicos para cada fármaco.

PRUEBAS DE LABORATORIO ÚTILES PARA EL CONTROL/MONITORIZACIÓN DE
FÁRMACOS ANTICOAGULANTES 13,16

Tiempo de protrombina. Explora la vía extrínseca. Ya que en esta intervienen la mayoría de factores vitamina-K dependientes, es ideal para la monitorización de los fármacos anti-vitamina K. El resultado se expresa en forma de ratio normalizado o INR.

TTPA. Explora la vía intrínseca. Es muy sensible a la presencia de fármacos con actividad anti-IIa. Se utiliza para monitorizar la heparina no fraccionada. Se expresa en ratio. Es útil como medida cualitativa de la presencia de dabigatrán, pero no sirve para su cuantificación. Existe una prueba equivalente al TTPA pero “a pie de cama” para evaluar de una forma muy rápida el grado de heparinización del paciente, es un tiempo de coagulación global y consiste en añadir a sangre total un activador tipo caolín y medir el tiempo de coagulación en segundos. Es útil para quirófanos de cirugía cardiaca.

Tiempo de trombina diluido. Es una modificación al tiempo de trombina. Útil para la medida del efecto anticoagulante de dabigatrán. Permite su cuantificación.

Tiempo de ecarina. También se puede medir el efecto anticoagulante de dabigatrán mediante el tiempo de ecarina.

Determinación de la actividad anti-Xa. Como su nombre indica permite la cuantificación de la actividad anti-Xa y puede ser utilizado para la medida del efecto anticoagulante de HBPM, rivaroxabán, apixabán y edoxabán, en los tres últimos casos es necesario utilizar calibradores adecuados.

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  13. De Caterina R, Husted S, Wallentin L, Andreotti F, Arnesen H, Bachmann F, et al. Position paper of the ESC working group on thrombosis-task force on anticoagulants in heart disease. Vitamin K antagonists in heart disease: Current status and perspectives. Thromb Haemost. 2013;110(6):1087-107.
  14. Büller HR, Bethune C, Bhanot S, Gailani D, Monia BP, Raskob GE, et al. Factor XI antisense oligonucleotide for prevention of venous thrombosis. N Engl J Med. 2015;372(3):232-40.
  15. Lippi G, Plebani M, Favaloro E. Technological Advances in the Hemostasis Laboratory. Semin Thromb Hemost. 2014;40(2): 178-85.
  16. De Caterina R, Husted S, Wallentin L, Andreotti F, Arnesen H, Bachmann F, et al. Position paper of the ESC working group on thrombosis-task force on anticoagulants in heart disease. Parenteral anticoagulants in heart disease: Current status and perspectives. Thromb Haemost. 2013;109(5):769-86.

    1.2 TRASTORNOS TROMBOFÍLICOS

La enfermedad tromboembólica venosa (ETEV) es una enfermedad compleja, multifactorial, resultado de la interacción de diferentes factores congénitos (se trataría de una enfermedad poligénica) y ambientales1.

Se estima que hasta un 60% de la variación de la susceptibilidad (heredabilidad) a la trombosis venosa es atribuible a factores genéticos2

El término trombofilia se utiliza para describir un desorden en la hemostasia ligado a la presencia de factores genéticos o adquiridos que condiciona una predisposición para desencadenar un episodio tromboembólico.

En el presente capítulo primero describiremos en detalle las principales alteraciones trombofílicas hereditarias y adquiridas y posteriormente abordaremos el papel actual e indicaciones de los estudios de trombofilia.

TROMBOFILIA CONGÉNITA O HEREDITARIA

Introducción

Alrededor del 30-40% de los casos con ETEV que acuden a una puerta de urgencias presenta alguna alteración genética que incrementa el riesgo trombótico, como se aprecia en la Tabla 1. Esta tabla también muestra datos de frecuencia y asociación con un primer episodio trombótico3.

Las manifestaciones clínicas suelen ser similares en todos los casos de trombofilia congénita.

No existen rasgos clínicos claramente diferenciadores (Tabla 2). Clásicamente, se ha establecido que la trombofilia hereditaria se caracteriza por trombosis de localización venosa, con historia familiar, habitualmente siguiendo un patrón de herencia autosómica dominante.

El primer episodio trombótico puede aparecer en sujetos jóvenes y, en ocasiones, la primera manifestación tiene lugar en localizaciones anatómicas poco frecuentes (trombosis mesentérica, cerebral, etc.)

Antes de describir en detalle los principales estados de trombofilia congénita, es importante destacar:

– Aunque el 30-40% de los casos con trombosis venosa tengan alguna alteración genética protrombótica no se excluye que aquellos pacientes negativos para estas determinaciones no tengan algún factor de riesgo genético aún no identificado.

– La identificación de una alteración genética, aunque esté ligada a un importante riesgo trombótico, no siempre explica por sí sola el desarrollo de la oclusión vascular. Un mismo defecto trombofílico puede tener diferente penetrancia clínica. La identificación de una alteración trombofílica en un paciente no descarta que pueda tener otra. De hecho, la combinación de defectos incrementa aditiva o sinérgicamente el riesgo trombótico.

– Diversas situaciones adquiridas ocasionan disminuciones transitorias de proteínas relacionadas con riesgo trombótico (por ejemplo, un déficit de antitrombina puede estar ocasionado por el tratamiento con L-asparaginasa). Por ello, para considerar un defecto como congénito debe ser permanente y suele afectar a otros miembros de la familia, ya que los casos debidos a mutación espontánea son raros, aunque no inexistentes.

TABLA 1.

INCIDENCIA Y RIESGO TROMBÓTICO ASOCIADO CON LAS PRINCIPALES

AT: antitrombina; PC: proteína C; PS: proteína S; FV: factor V; PT: protrombina 20210A; ETEV: enfermedad tromboembólica venosa.

TABLA 2.

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DE LA TROMBOFILIA HEREDITARIA

Deficiencia de anticoagulantes naturales

Englobamos en un mismo apartado las deficiencias de tres anticoagulantes naturales asociadas con trombofilia congénita, antitrombina (AT), proteína C (PC) y proteína S (PS), porque presentan múltiples similitudes.

En primer lugar, fueron las primeras identificadas (AT en 1965, PC y PS en la década de los ochenta). En general, se producen por mutaciones puntuales que afectan a un solo alelo (menos frecuentemente deleciones o inserciones, e inusuales, y siempre con efecto funcional moderado, los casos homocigotos).

Dependiendo del efecto final de la alteración genética, se diferencian dos tipos de deficiencia:

Tipo I, con disminución/ausencia de la proteína mutada en plasma, debido a que el alelo mutado no se traduce o la proteína mutada no se secreta.

Tipo II, con niveles plasmáticos elevados (no necesariamente iguales a los niveles de la proteína no mutada) de una proteína mutada con menor o nula actividad funcional.

Estas deficiencias se asocian en general con elevado riesgo trombótico y la ausencia completa causa letalidad embrionaria (AT) o púrpura fulminans del recién nacido (PC o PS).

Estas características justifican que actualmente sean los defectos trombofílicos cuya identificación, tanto en pacientes sintomáticos como familiares asintomáticos, tiene mayor utilidad clínica en la prevención del primer episodio trombótico mediante profilaxis en situaciones de riesgo4, y reducción de recurrencia por prolongación del tratamiento anticoagulante oral en pacientes con ETEV5 (Tabla 3).

TABLA 3.

UTILIDAD CLÍNICA DEL DIAGNÓSTICO DE ALTERACIONES TROMBOFÍLICAS*

AT: antitrombina; PC: proteína C; PS: proteína S; FV: factor V; ETEV: enfermedad tromboembólica venosa
*Adaptado de Mahmoodi BK, et al. J Thromb Haemost. 2010 y Lijfering WM, et al. Blood. 2009.

a) Deficiencia de antitrombina

La AT es una serpina que actúa como excelente y eficaz inhibidor de las principales serín-proteasas de la coagulación, especialmente a la trombina y al FXa, pero también al FVIIa, FIXa, FXIa y FXIIa. Este proceso es significativamente potenciado en presencia de glicosaminoglicanos (Figura 1), lo que explica el mecanismo anticoagulante de las heparinas, tanto no fraccionada como de bajo peso molecular.

FIGURA 1.

ANTITROMBINA

El diagnóstico inicial de deficiencia de AT se lleva a cabo empleando pruebas funcionales, normalmente empleando métodos amidolíticos cromogénicos basados en la cuantificación de la actividad anti-FXa o anti-IIa (Tabla 4 y Figura 2).

En caso de alteración en la prueba funcional, se precisa continuar el estudio determinando los niveles antigénicos y la afinidad por heparina de la AT plasmática (normalmente empleando inmunoelectroforesis cruzada en presencia de heparina).

En un tercer paso, el diagnóstico molecular es también interesante (más del 95% de los casos se resuelven secuenciando los 7 exones y regiones flanqueantes del gen codificante, SERPINC1), ya que aporta información relevante sobre el mecanismo responsable de la deficiencia, con potencial valor pronóstico. Hasta la fecha se han descrito más de 250 alteraciones genéticas diferentes en el gen SERPINC1 asociadas con deficiencia de AT.

TABLA 4.

CÓMO REALIZAR ESTUDIO DE TROMBOFILIA: AT

En el diagnóstico inicial es a través de pruebas funcionales. Si estas pruebas resultan alteradas, se precisa continuar el estudio determinando los niveles antigénicos y la afinidad por heparina de la AT plasmática. En un tercer paso, se realizan pruebas moleculares para el diagnóstico, tienen un potencial valor pronóstico.

FIGURA 2.

CÓMO REALIZAR ESTUDIO DE TROMBOFILIA: AT

Adaptado de Khor B & Van Cott EM. Am J Hematol 2010; 85: 947-50.

Algoritmo de diagnóstico de la deficiencia de AT que destaca la posible interferencia de fármacos en la técnica amidolítica, así como diversas situaciones clínicas que podrían condicionar una deficiencia adquirida de AT.

La deficiencia de AT tipo I, cuantitativa, se asocia con elevado riesgo trombótico, mientras que la deficiencia tipo II, cualitativa, presenta mayor heterogeneidad clínica.

En las deficiencias tipo II se pueden diferenciar tres subgrupos:

Defectos del sitio reactivo. Causadas por mutaciones que afectan directamente al centro reactivo de la molécula e interfieren o anulan la capacidad anticoagulante de la AT. Presentan gran heterogeneidad clínica, desde muy moderados como la AT Cambridge II (Ala384Ser) a muy severos como la AT London (del Arg393).

Defectos del sitio de unión a heparina. Reducen la afinidad por heparina y, por tanto, la activación de la AT por glicosaminoglicanos. Generalmente son las que menor riesgo trombótico tienen.

Defectos pleiotrópicos. La mutación genera variantes con afinidad por heparina y mecanismo inhibitorio afectados. Suelen ser graves desde un punto de vista clínico.

Aunque el aumento del riesgo trombótico asociado a la deficiencia de AT sea alto (x 10-50 veces), la muy baja incidencia del déficit de este anticoagulante en la población general (0,02%) explica que sean pocos los pacientes con ETEV que presentan esta trombofilia congénita (0,5-2%) (Tabla 1Tabla 3).

Sin embargo, la elevada tasa de recurrencia en portadores y las ventajas clínicas de su diagnóstico justifica su estudio tanto en pacientes con trombosis venosa como en sus familiares (Tabla 3).

La probabilidad de evento trombótico en sujetos portadores de alteraciones trombofílicas congénitas a diferentes edades constata que la deficiencia de antitrombina es la que se asocia con mayor riesgo trombótico a cualquier edad6(Figura 3).

FIGURA 3.

PROBABILIDAD DE ETEV EN SUJETOS PORTADORES DE UNA TROMBOFILIA CONGÉNITA SEGÚN LA EDA

Con la edad aumenta el riesgo de ETEV, se puede constatar que la deficiencia de antitrombina se asocia con un mayor riesgo trombótico a cualquier edad.

b) Deficiencia de proteína C

La deficiencia homocigota (extraordinariamente infrecuente) causa un cuadro de púrpura fulminans en neonatosEl segundo sistema anticoagulante más importante del organismo es el de la PC. Una vez activada por la trombina en presencia de trombomodulina, la PC activada (PCa) ejerce su papel anticoagulante inactivando los factores VIIIa y Va (Figura 4). Por ello, la deficiencia heterocigota de PC implica un importante riesgo trombótico.

FIGURA 4.

SISTEMA DE LA PROTEÍNA C

A. La trombina (IIa), además de inducir la transformación del fibrinógeno en fibrina, puede unirse a una proteína de membrana del endotelio, la trombomodulina (TM). La proteína C circulante se une al complejo trombina-trombomodulina (esta unión se ve muy favorecida en presencia del receptor endotelial de la proteína C: EPCR) y es activada.

B. La proteína C activada (PCa) en presencia de PS degrada a los factores Va y VIIIa.

El diagnóstico de deficiencia de PC se realiza inicialmente mediante determinaciones funcionales (tanto coagulantes como cromogénicas) (Tabla 5), y antigénicas, que permiten identificar y diagnosticar los dos tipos de deficiencia de PC:

Tipo I (cuantitativa), que es el más común.

Tipo II (cualitativa).

El estudio genético también es relativamente sencillo de realizar (el gen contiene solo 8 exones codificantes), pero hay menos datos sobre la utilidad clínica de dicha información. Se han descrito más de 270 mutaciones diferentes en el gen que codifica la PC en pacientes con deficiencia de este anticoagulante.

Como sucede con la deficiencia de AT, la prevalencia de la deficiencia de PC en la población general es baja (0,2-0,4%), mientras que en pacientes con ETEV está entre el 2,5-6% (Tabla 1 y Tabla 3).

De nuevo, el riesgo de trombosis tanto relativo como absoluto es alto (10-15 veces y 7 veces, respectivamente) y aumenta con la edad (Figura 4).

Finalmente, la tasa de recurrencia, es también elevada. Todos estos datos y las ventajas clínicas de su diagnóstico justificarían su estudio, tanto en pacientes con trombosis venosa como en familiares asintomáticos7.

TABLA 5.

CÓMO REALIZAR ESTUDIO DE TROMBOFILIA: PC

c) Deficiencia de proteína S

La proteína S participa como cofactor de la PCa (Figura 4). Por tanto, su déficit afecta principalmente al mecanismo anticoagulante de la PC.

Aproximadamente, el 60-80% de la PS en plasma forma un complejo con una proteína reguladora del complemento (C4bBP). Solo la fracción de PS libre tiene actividad anticoagulante. Empleando sistemas de cuantificación de niveles antigénicos totales y libres de proteína S, así como pruebas funcionales que evalúan la actividad de la proteína S como cofactor de la PCa se pueden definir tres tipos de deficiencia de PS (Tabla 6):

– Tipo I. Niveles antigénicos de PS total y libre reducidos. Por supuesto, asocian baja actividad funcional. Son la mayoría, dos tercios de los casos de déficit de PS.

– Tipo II. Niveles antigénicos (totales y libres) normales, pero baja actividad funcional como cofactor de la PCa. Es el tipo más raro.

– Tipo III. Niveles de proteína total normales, con niveles de proteína libre bajos, debido al aumento de PS unida a C4bBP. Se identifican en un tercio de los casos con déficit de PS.

TABLA 6.

CÓMO REALIZAR ESTUDIO DE TROMBOFILIA: PS

A diferencia de los otros dos anticoagulantes naturales, para los que las deficiencias adquiridas son relativamente poco frecuentes (con la excepción de hepatopatías), en el caso de la PS, además, los anticonceptivos orales y el tratamiento hormonal sustitutivo reducen sus niveles. El embarazo también causa una progresiva reducción de los niveles de PS.

En pacientes con anticuerpos antifosfolípidos se ha observado un estado adquirido de deficiencia de PS, así como en casos de coagulación intravascular diseminada y enfermedad hepática. Por este motivo, con frecuencia se llega a diagnósticos incorrectos de deficiencia congénita de PS (Tabla 7).

TABLA 7.

DIFICULTADES EN EL DIAGNÓSTICO DE DEFICIENCIAS DE PC Y PS

Adaptado de: Bereczky S, et al.  Clin Chem Lab Med 2010; 48 (suppl 1): S53-S66

La prevalencia del déficit de PS en la población general no se conoce con exactitud, se estima entre el 0,03 y el 0,13%, mientras que asciende hasta el 1-3% en pacientes con ETEV

La deficiencia normalmente es heterocigota, siendo muy infrecuente la deficiencia en homocigosis. Al igual que con la deficiencia de PC, el déficit homocigoto causa púrpura fulminans en neonatos. El riesgo relativo de trombosis venosa en individuos con deficiencia hereditaria de PS es de 11,5, con alta incidencia de recurrencias tras finalizar el tratamiento anticoagulante (Tabla 1 y Tabla 3).

El análisis genético de la PS es más complejo, pues existen dos genes homólogos para la proteína: PROS1 (responsable de la mayoría de las deficiencias de tipos I y II) y el pseudogén PROSP. Además, solo un 50% de los pacientes con deficiencia de PS tienen alguna mutación en el gen PROS1. Se han descrito más de 234 mutaciones puntuales diferentes8.En los pacientes con deficiencia conocida de PC o PS es imprescindible asegurar una correcta anticoagulación con heparina (no fraccionada o de bajo peso molecular) antes del inicio del tratamiento con AVK

Tanto la PC como la PS son dos proteínas vitamina K dependientes. En pacientes con deficiencia de alguna de ellas, al iniciar tratamiento anticoagulante con acenocumarol o warfarina puede desencadenarse un cuadro de necrosis cutánea, ya que el inicial descenso acusado de estas proteínas, inducido por el antagonista de la vitamina K (AVK), favorece la formación de coágulos de fibrina en los pequeños vasos de la piel.

Para evitar el desarrollo de esta complicación, en los pacientes con deficiencia conocida de PC o PS es imprescindible asegurar una correcta anticoagulación con heparina (no fraccionada o de bajo peso molecular) antes del inicio del tratamiento con AVK. Además, el solapamiento de ambos tratamientos debe ser prolongado, comenzando con dosis de AVK inferiores a las habituales.

Polimorfismos protrombóticos

El estudio de estos polimorfismos en otras circunstancias como complicaciones obstétricas, trombosis arterial o exposición a situaciones de alto riesgo trombótico, se restringe a los casos con historia personal o familiar de trombosis venosa significativa9 En la década de los noventa se produjo una revolución en la visión de la trombofilia con la identificación por parte del grupo de la Universidad de Leiden (Holanda) de los polimorfismos del factor V Leiden y la protrombina G20210A. Ambos son cambios frecuentes en la población general (>1%) con efecto funcional, e incrementan de forma moderada (en heterocigosis) el riesgo trombótico. Con estos descubrimientos, la trombosis venosa pasó a ser considerada una enfermedad poligénica.

Pese a la elevada prevalencia de estos polimorfismos en pacientes con ETEV, aspecto que junto a la sencillez diagnóstica han propiciado una elevada tasa de solicitudes de detección de estos defectos en los laboratorios, su trascendencia clínica es mucho más cuestionada y se restringe, incluso con poca evidencia bibliográfica, a los defectos en homocigosis o las heterocigosis compuestas en pacientes con trombosis venosa y familiares asintomáticos.

a) Factor V Leiden y resistencia a la proteína C activada

El factor V Leiden constituye la trombofilia hereditaria más frecuente en nuestro medio. Es el resultado de una mutación puntual que cambia la arginina por glutámico en el primer sitio de ruptura proteolítica del FV activo por la PCa (Arg506Gln).

La consecuencia funcional de este simple cambio de aminoácido es un FVa más resistente a la inactivación por la PCa (Figura 5).

De esta forma, el tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa) de un portador de la mutación apenas se prolonga tras la adición de PCa, lo que se denomina resistencia a la PCa.

Aunque todos los casos con FV Leiden presentan resistencia a la PCa, existen casos de resistencia a la proteína C activada (RPCa) por otras causas diferentes (Tabla 8).

FIGURA 5.

FACTOR V LEIDEN

El factor V Leiden es el resultado de una mutación puntual (adenina por guanina) en el nucleótido 1691, en el exón 10. Este simple cambio de nucleótido implica el cambio del aminoácido arginina por glutámico en el primer sitio de ruptura proteolítica del FV activo por la PCa. La consecuencia funcional de este simple cambio de aminoácido es un FVa más resistente a la inactivación por la PCa.

TABLA 8.

CAUSAS DE RESISTENCIA A LA PCA

El FV Leiden es la causa mayoritaria de resistencia a la PCa, aunque existen casos de resistencia a la RPCa por otras causas diferentes.

La frecuencia de esta alteración en la población general es alta (4% de la población española, y hasta el 10% en el norte de Europa) y aumenta al 20% en pacientes no seleccionados con trombosis venosa, por tanto incrementa de forma moderada el riesgo de trombosis venosa (3-7 veces en heterocigotos, aunque en homocigotos el riesgo aumenta hasta 20 veces).

El riesgo absoluto de desarrollar trombosis venosa en portadores del FV Leiden es considerablemente inferior al descrito en las deficiencias de proteínas anticoagulantes (2,2 veces en heterocigosis), y el riesgo de recurrencia, aunque estadísticamente significativo (aumenta 1,3 veces), es tan bajo que apenas tiene utilidad clínica10 (Tabla 1 y Tabla 3).

b) Protrombina G20210A

Es un cambio de un solo nucleótido (SNP, en inglés) que afecta a la zona 3’ no codificante del gen de la protrombina. Se asocia con ligero aumento de los niveles de esta molécula en plasma.El alelo 20210A está presente en el 3% de la población española sana (<0,1% en homocigosis), pero asciende hasta el 6-9% en los pacientes con ETEV. Por tanto, el riesgo relativo de trombosis venosa en portadores es 3-4 veces mayor que en no portadores, valores que ascienden a 10-20 en homocigotos

El alelo 20210A está presente en el 3% de la población española sana (<0,1% en homocigosis), pero asciende hasta el 6-9% en los pacientes con ETEV. Por tanto, el riesgo relativo de trombosis venosa en portadores es 3-4 veces mayor que en no portadores, valores que ascienden a 10-20 en homocigotos.

El riesgo absoluto de desarrollar trombosis venosa en portadores del polimorfismo es similar al del FV Leiden y el riesgo de recurrencia bajo (1,2 veces) (Tabla 1 y Tabla 3)11.

El diagnóstico de FV Leiden y de la protrombina G20210A es sencillo, realizándose de forma rápida mediante la utilización de kits comerciales para PCR en tiempo real.

c) Otras alteraciones genéticas

Existen otras alteraciones genéticas que se han implicado en el incremento de riesgo trombótico, tanto mutaciones poco frecuentes como por ejemplo las responsables de disfibrinogenemia, como polimorfismos que afectan a diferentes elementos del sistema hemostático y muchos otros que se han descrito en estudios de genotipado masivo12 y cuya relevancia clínica y aplicación diagnóstica todavía tienen que contrastarse. En este apartado haremos referencia a dos situaciones antagónicas:

– El grupo sanguíneo ABO, definido por una serie de polimorfismos, clara y consistentemente se asocia con riesgo trombótico. Los grupos no-O, excepto el A2, asociados con mayores niveles de FVIII y FvW, incrementan casi dos veces el riesgo trombótico, deberían incluirse en estudios de trombofilia13.

– El polimorfismo C677T de la metilen-tetrahidrofolato-reductasa (MTHFR) que, al estar incorporado en sistemas comerciales automatizados de trombofilia congénita, se realiza frecuentemente. Este polimorfismo implica un cambio de alanina por valina en el aminoácido 223, que condiciona una termolabilidad de la enzima, de forma que a 37°C su actividad es un 50% menor que la de la variante normal. El alelo 677T, sobre todo en homocigosis, se asocia con mayores niveles plasmáticos de homocisteína (Tabla 9).

La hiperhomocisteinemia (en la que influyen tanto factores hereditarios como adquiridos) inicialmente se asoció con un mayor riesgo trombótico, sobre todo en territorio arterial, aunque en la actualidad esta asociación es controvertida14. Pero el estudio del polimorfismo MTHFR-C677T no debería incluirse en los estudios de trombofilia congénita, ya que únicamente aporta preocupación injustificada a los pacientes.

En un reciente metaanálisis icluyendo más de 11 000 pacientes con ETEV y 21 000 controles, no se observó una asociación significativa de la homocigosis MTHFR-677TT con el riesgo de trombosis15.

TABLA 9.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE HOMOCISTEÍNA

En los niveles plasmáticos de homocisteína influyen múltiples factores, tanto hereditarios como adquiridos. La asociación de hiperhomocisteinemia con un mayor riesgo trombótico, sobre todo en territorio arterial, es controvertida. En lo que sí existe unanimidad es en la nula utilidad de la inclusión del polimorfismo MTHFR-C677T en los estudios de trombofilia. Por otra parte, hasta la fecha tampoco se ha demostrado que la administración de suplementos de ácido fólico y vitamina B12 a individuos con hiperhomocisteinemia moderada, con el fin de reducir sus niveles, se asocie con una reducción del riesgo de eventos trombóticos.

Adaptado de Di Minno MN, et al.  Thromb Haemost. 2010. 103: 942-61.

El aumento de los niveles plasmáticos de FVIII, FIX y FXI también puede incrementar el riesgo trombótico, si bien hasta la fecha no se ha caracterizado la alteración (o alteraciones) genética responsable. Una pega adicional es que el aumento de riesgo trombótico asociado a la concentración de los factores sería una función continua, por lo que la fijación de puntos de corte no dejaría de tener cierto carácter arbitrario. Además, hay que tener en cuenta el alto número de variables preanalíticas y condiciones clínicas que pueden influir en el resultado de una determinación puntual de estos niveles16.

Defectos combinados

La combinación más relevante, la de los dos polimorfismos más comunes, FV Leiden y protrombina 20210A, incrementa 20 veces el riesgo de trombosis Como hemos comentado anteriormente, la trombosis es una enfermedad poligénica y por ello la combinación de defectos trombofílicos, si bien tiene una incidencia baja, aumenta, aditiva o incluso sinérgicamente, el riesgo trombótico.

En los últimos años estamos asistiendo al desarrollo de algoritmos predictivos que cuantifican el riesgo trombótico asociado con perfiles genéticos complejos definidos por múltiples polimorfismos y que con seguridad dotarán de mayor aplicación clínica a los estudios de trombofilia (Figura 6)17.

Por el contrario, los resultados obtenidos hasta la fecha en ambiciosos estudios tipo Genomic Wide Association Studies (GWAS) han sido francamente desalentadores18.

FIGURA 6.

ANÁLISIS COMBINADO DE MÚLTIPLES SNPS EN ETEV

Ejemplo de plataforma Thromboincode para el análisis combinado de 12 variantes alélicas en 7 genes para la evaluación del riesgo de ETEV.

El desarrollo de algoritmos predictivos que cuantifican el riesgo trombótico asociado con perfiles genéticos complejos definidos por múltiples polimorfismos va a dotar de mayor aplicación clínica a los estudios de trombofilia.

TROMBOFILIA ADQUIRIDA

Estados de trombofilia adquirida

Los estados de trombofilia adquirida o secundaria deben ser considerados en aquellos pacientes con tromboembolismo venoso espontáneo o idiopático, sin un factor desencadenante obvio, como la inmovilización, obesidad o cirugía. Se da en un número importante de situaciones que se reflejan en la Tabla 10.

TABLA 10.

ESTADOS DE TROMBOFILIA ADQUIRIDA

Existen numerosas situaciones clínicas que condicionan el desarrollo de una situación de hipercoagulabilidad/trombofilia adquirida, por mecanismos muy variados, asociándose a un incremento significativo del riesgo de ETEV.

  • Cáncer oculto

En caso de no encontrar alteraciones, algunas guías clínicas como la NICE 2012, recomiendan en pacientes mayores de 40 años completar el estudio mediante TAC de tórax y abdomen y en las mujeres realizar también una mamografía Hasta el 10% de los pacientes que presentan un episodio de ETEV no provocado presentan una neoplasia oculta. La realización sistemática de exploraciones complementarias dirigidas a la detección de cáncer oculto en este contexto es motivo de controversia.

Aunque en teoría, cabría pensar que la realización de procedimientos de despistaje de cáncer oculto se asociaría con un diagnóstico más precoz, y por tanto una mejoría en el pronóstico de los pacientes, hasta la fecha ningún estudio ha demostrado un impacto positivo en términos de supervivencia de la implementación de protocolos de este tipo.

Por otra parte, no existe unanimidad acerca de qué exploraciones complementarias se deberían incluir en el cribado, existiendo discrepancias acerca de su coste/beneficio. Está claro que en todo paciente con un episodio de ETEV no provocada se debería realizar una anamnesis dirigida y una exploración física completa con el fin de detectar síntomas y signos sugestivos de posible neoplasia oculta.

En caso de no encontrar alteraciones, algunas guías clínicas como la NICE 2012, recomiendan en pacientes mayores de 40 años completar el estudio mediante TAC de tórax y abdomen y en las mujeres realizar también una mamografía19.

Recientemente se ha evaluado la potencial utilidad de la tomografía por emisión de positrones (PET-CT) como herramienta única para el cribado de cáncer oculto en pacientes con ETEV idiopática. Aunque los resultados iniciales han sido positivos por la elevada sensibilidad de esta técnica diagnóstica, su alto coste supone una importante limitación20.

  • Patología hematológica

Diferentes cuadros hematológicos incrementan el riesgo de aparición de complicaciones tromboembólicas, como los síndromes mieloproliferativos crónicos tipo trombocitemia esencial y policitemia vera.

También la hemoglobinuria paroxística nocturna y otros tipos de procesos asociados con hemólisis, como la anemia falciforme.

Con frecuencia, en el contexto de estos procesos las complicaciones trombóticas acontecen en localizaciones inusuales (territorio esplácnico o senos venosos cerebrales).

La complicación trombótica puede constituir, en ocasiones, la primera manifestación clínica de la enfermedad. Por este motivo, sobre todo en caso de trombosis venosas en territorio esplácnico no justificadas por otras causas, algunos recomiendan la realización del análisis molecular de JAK2. La alteración de este gen (la más frecuente la V617F) es muy característica de síndromes mieloproliferativos crónicos y se asocia con un incremento significativo del riesgo trombótico21.

  • Síndrome antifosfolipídico

El síndrome antifosfolipídico (SAF) es quizás la principal causa de trombofilia adquirida.

Los datos clínicos que sugieren la existencia de SAF incluyen historia de abortos de repetición, historia personal de trombosis arterial o venosa y trombocitopenia (Tabla 11). En estos casos, se recomienda evaluar el anticoagulante lúpico, anticuerpos anticardiolipina y anticuerpos anti-β2-glicoproteína I.

Es importante destacar la necesidad de confirmación diagnóstica de la positividad de anticuerpo antifosfolipídico (AAF) en una segunda muestra separada al menos 6 semanas de la inicial22. Debido al alto riesgo de recurrencia asociado a los pacientes con diagnóstico de SAF, se recomienda anticoagulación a largo plazo, incluso tras el primer episodio de trombosis venosa.

Sin embargo, el riesgo de complicaciones trombóticas varía en función del tipo de AAF, siendo claramente superior para los individuos con positividad del anticoagulante lúpico o con triple positividad.

TABLA 11.

DIAGNÓSTICO DEL SÍNDROME ANTIFOSFOLIPÍDICO

Criterios de Sidney (2006) para el diagnóstico de síndrome antifosfolipídico (SAF), que son los vigentes en la actualidad. Los datos clínicos que sugieren la existencia de un SAF incluyen historia de abortos de repetición, historia personal de trombosis arterial o venosa y trombocitopenia. En estos casos, se recomienda evaluar el anticoagulante lúpico, anticuerpos anticardiolipina y anticuerpos anti-β2-glicoproteína I. Es importante destacar la necesidad de confirmación diagnóstica de la positividad de anticuerpo antifosfolipídico en una segunda muestra separada al menos 12 semanas de la inicial.

Pertinencia de los estudios de trombofilia congénita

La perspectiva de los estudios de trombofilia se ha ensombrecido en los últimos años23.

De considerarse un cribado prácticamente universal, hemos pasado a cuestionarse por completo la utilidad clínica de estos estudios, si bien existen diferencias en las recomendaciones de diferentes guías de práctica clínica (Tabla 12)24.

La principal razón es la escasa utilidad clínica de un diagnóstico de trombofilia, especialmente de los polimorfismos protrombóticos, en el manejo de los pacientes (particularmente en lo que a la duración del tratamiento anticoagulante tras un episodio de ETEV respecta).

Existen argumentos, tanto a favor como en contra, de realizar estos estudios tanto en pacientes con trombosis venosa como en familiares asintomáticos de pacientes con trombofilia, que se resumen en las Tabla 13 y Tabla 1425.

TABLA 12.

DIFERENCIAS ENTRE LAS RECOMENDACIONES DE LAS DISTINTAS GUÍAS CLÍNICAS

Adaptado de De Stefano V & Rossi, E. Thromb Haemost 2013; 110:97-705.

TABLA 13.

PERTINENCIA DE LA REALIZACIÓN DE ESTUDIOS DE TROMBOFILIA CONGÉNITA EN PACIENTES CON ETEV

Argumentos para defender las posturas “a favor” y “en contra” de la realización de estudios de trombofilia hereditaria en pacientes con historia de ETEV.

TABLA 14.

PERTINENCIA DE LA REALIZACIÓN DE ESTUDIOS DE TROMBOFILIA CONGÉNITA EN FAMILIARES DE PORTADORES

Argumentos para defender las posturas “a favor” y “en contra” de la realización de estudios de trombofilia hereditaria en familiares asintomáticos de pacientes portadores de algún defecto.

Sin embargo, la mayoría de las recomendaciones de las guías se basan en evidencia de calidad baja. Existe una relación inversa entre la rareza de una alteración trombofílica y su penetrancia clínica.

La susceptibilidad a la ETEV se ve modulada por la presencia o ausencia de historia familiar, lo que puede influir en las decisiones terapéuticas. Es poco probable, debido a la relativa infrecuencia de algunos de los defectos trombofílicos, que se realicen estudios aleatorizados controlados que evalúen el impacto de diversas estrategias de tratamiento en portadores de los mismos.

En términos generales, por la relativa sencillez de su estudio y por la información que aportan acerca del conocimiento de la enfermedad, los estudios tienen su validez y, en ciertos casos (sobre todo en caso de deficiencias de anticoagulantes y defectos combinados de polimorfismos protrombóticos), podría tener utilidad clínica: ampliar el periodo de anticoagulación en pacientes para evitar recurrencias (siempre dando un peso relevante a otros elementos clínicos como la historia personal y familiar de trombosis, el carácter idiopático, niveles elevados de dímero D) o prevención del primer evento en sujetos asintomáticos en situaciones de riesgo trombótico.

En este sentido, recientemente se ha demostrado que el genotipo y forma de presentación clínica en el sujeto probando influye en el riesgo trombótico de los familiares con FV Leiden o protrombina 20210A26. En ningún caso la identificación de un defecto trombofílico modifica la intensidad, esquema o tipo de tratamiento anticoagulante.

En la práctica diaria asistimos a la solicitud de estudios de trombofilia hereditaria en multitud de situaciones en las que no estarían indicados, lo que implica un considerable consumo de recursos27.

Recientemente, dentro del programa Choosing Wisely de la Sociedad Americana de Hematología (ASH), dirigido a mejorar la calidad asistencial, se realizó un posicionamiento claro y rotundo en contra de la realización de estudios de trombofilia en pacientes adultos que hayan sufrido un episodio de ETEV en el contexto de un factor de riesgo transitorio “mayor” (cirugía, trauma o inmovilización prolongada)28.

Los estudios de trombofilia deberían ser solicitados por profesionales de la salud que puedan asegurar las siguientes condiciones29:

  • Selección apropiada del paciente al que se solicita el estudio.
  • Proporcionar consejo previo al procedimiento.
  • Interpretación adecuada de los resultados.
  • Proporcionar adecuada educación al paciente.

Existe una relación inversa entre la rareza de una alteración trombofílica y su pentrancia clínica26

Merece la pena destacar, que con la excepción de los AAF, no se recomienda la realización de estudios de trombofilia en pacientes con trombosis en territorio arterial (síndrome coronario agudo, ictus isquémico o trombosis arterial periférica).

Otra cuestión de interés es establecer el momento óptimo para la realización del estudio de trombofilia. La Tabla 15 resume y justifica los momentos que deben ser elegidos para realizar estos estudios. Igualmente, en la Figura 7 se muestra un algoritmo para orientar el diagnóstico biológico de los estados de trombofilia.

TABLA 15.

INDICACIÓN DEL MOMENTO PARA REALIZAR EL ESTUDIO DE TROMBOFILIA HEREDITARIA

Los anticoagulantes orales de acción directa también interfieren con la medición de los niveles funcionales de AT, PC y PS.

FIGURA 7.

ALGORITMO DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO DE TROMBOFILIA

SAF: síndrome antifosfolípido; AL: Anticoagulante lúpico; AA: Anticuerpos antifosfolípido (Anticuerpos anticardiolipina y anti b2-GPI); PS: proteína S; PC: Proteína C; AT: Antitrombina; PT: protrombina; RPCa: resistencia a proteína C activada; AO: Anticonceptivos orales; THS: Terapia hormonal sustitutiva; LES: Lupus eritematoso sistémico; CIE: Cross-inmunoelectroforesis.

CONCLUSIONES

• En las últimas décadas se han identificado nuevos factores trombofílicos, muchos de ellos genéticos, y en los próximos años probablemente surgirán más.

• La identificación de una alteración trombofílica supone un mayor riesgo trombótico, pero no necesariamente ha de ser el responsable del desarrollo de la trombosis ni implicar que el portador vaya a tener un episodio trombótico. De hecho, el riesgo trombótico de cada defecto es variable, incluso para una misma alteración, como consecuencia tanto de la heterogeneidad molecular como, fundamentalmente, del carácter multigénico y multifactorial de la trombosis venosa. Por ello, el an.lisis de trombofilia no puede entenderse de forma aislada, sino teniendo en cuenta la historia clínica personal y familiar del enfermo.

• Existen diferentes situaciones que generan estados de trombofília adquirida. La existencia de anticuerpos antifosfolipídicos, en especial el anticoagulante lúpico, es posiblemente el factor de riesgo más relevante y requiere una detenida atención.

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